Sự khác biệt chính - Xếp thứ tự NGS vs Sanger
Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) và Giải trình tự Sanger là hai loại kỹ thuật giải trình tự nucleotide được phát triển theo thời gian. Phương pháp giải trình tự Sanger đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm và NGS đã thay thế nó gần đây do những ưu điểm của nó. Sự khác biệt chính giữa NGS và Sanger Sequencing là NGS hoạt động trên nguyên tắc giải trình tự hàng triệu trình tự đồng thời một cách nhanh chóng thông qua một hệ thống giải trình tự trong khi Sanger Sequencing hoạt động dựa trên nguyên tắc kết thúc chuỗi do sự kết hợp có chọn lọc của các dideoxynucleotide bởi enzyme DNA polymerase trong quá trình sao chép DNA và kết quả là tách đoạn bằng điện di mao quản.
Trình tự Nucleotide là gì?
Thông tin di truyền được lưu trữ trong trình tự nucleotide của DNA hoặc RNA của một sinh vật. Quá trình xác định thứ tự chính xác của các nucleotit (sử dụng bốn bazơ) trong một đoạn nhất định (trong một gen, cụm gen, nhiễm sắc thể và bộ gen hoàn chỉnh) được gọi là giải trình tự nucleotit. Việc phân tích cấu trúc và chức năng của gen là rất quan trọng trong các nghiên cứu gen, nghiên cứu pháp y, virus học, hệ thống sinh học, chẩn đoán y tế, công nghệ sinh học và trong nhiều lĩnh vực khác. Có nhiều loại phương pháp giải trình tự khác nhau được phát triển bởi các nhà khoa học. Trong số đó, giải trình tự Sanger do Frederick Sanger phát triển vào năm 1977 đã được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong một thời gian dài cho đến khi Trình tự thế hệ tiếp theo thay thế nó.
NGS là gì?
Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) là một thuật ngữ được sử dụng để chỉ các quy trình giải trình tự thông lượng cao hiện đại. Nó mô tả một số công nghệ giải trình tự hiện đại khác nhau đã cách mạng hóa các nghiên cứu bộ gen và Sinh học phân tử. Các kỹ thuật đó là giải trình tự Illumina, giải trình tự Roche 454, giải trình tự Ion Proton và giải trình tự SOLiD (Sequencing bằng Oligo Ligation Detection). Hệ thống NGS nhanh hơn và rẻ hơn. Bốn phương pháp giải trình tự DNA chính được sử dụng trong hệ thống NGS là; giải trình tự pyrosequencing, giải trình tự bằng tổng hợp, giải trình tự bằng cách thắt và giải trình tự bán dẫn ion. Một số lượng lớn các sợi DNA hoặc RNA (hàng triệu) có thể được sắp xếp theo trình tự song song. Nó cho phép giải trình tự toàn bộ bộ gen của sinh vật trong một khoảng thời gian ngắn, không giống như giải trình tự Sanger mất nhiều thời gian hơn.
NGS có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp Sanger giải trình tự thông thường. Đây là một quá trình tốc độ cao, chính xác hơn và hiệu quả về chi phí, có thể được thực hiện với kích thước mẫu nhỏ. NGS có thể được sử dụng trong các nghiên cứu về hệ gen, trong việc phát hiện các biến thể trong bộ gen riêng lẻ do chèn và xóa, v.v. và trong phân tích các biểu hiện gen.
Hình_1: Sự phát triển trong chuỗi NGS
Sanger Sequencing là gì?
Sanger Sequencing là một phương pháp giải trình tự được phát triển bởi Frederick Sanger và các đồng nghiệp của ông vào năm 1977 để xác định thứ tự nucleotide chính xác của một đoạn DNA nhất định. Nó còn được gọi là giải trình tự kết thúc chuỗi hoặc giải trình tự Dideoxy. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này là kết thúc quá trình tổng hợp sợi bằng cách kết hợp có chọn lọc các dideoxynucleotide kết thúc chuỗi (ddNTPs) như ddGTP, ddCTP, ddATP và ddTTP bởi DNA polymerase trong quá trình sao chép DNA. Các nucleotide bình thường có 3 nhóm OH để hình thành liên kết phosphodiester giữa các nucleotide liền kề để tiếp tục hình thành sợi. Tuy nhiên, ddNTPs thiếu nhóm 3’OH này và không có khả năng hình thành liên kết phosphodiester giữa các nucleotide. Do đó, quá trình kéo dài chuỗi không còn nữa.
Trong phương pháp này, DNA sợi đơn được giải trình tự đóng vai trò là sợi khuôn để tổng hợp DNA trong ống nghiệm. Các yêu cầu khác là mồi oligonucleotide, tiền chất deoxynucleotide và enzyme DNA polymerase. Khi các đầu bên sườn của đoạn đích được biết, các đoạn mồi có thể dễ dàng được thiết kế để sao chép DNA. Bốn phản ứng tổng hợp DNA riêng biệt được thực hiện trong bốn ống riêng biệt. Mỗi ống có các ddNTP riêng biệt, cùng với các yêu cầu khác. Từ nucleotide cụ thể, một hỗn hợp dNTPs và ddNTPs được thêm vào. Tương tự như vậy, bốn phản ứng riêng biệt được thực hiện trong bốn ống với bốn hỗn hợp. Sau các phản ứng, việc phát hiện các đoạn DNA và chuyển đổi mẫu đoạn thành thông tin trình tự được thực hiện. Kết quả là các đoạn DNA được biến tính bằng nhiệt và được phân tách bằng điện di trên gel. Nếu sử dụng các nucleotide phóng xạ, dạng dải trong gel polyacrylamide có thể được hình dung bằng phương pháp chụp tự động. Khi phương pháp này sử dụng các dideoxynucleotide được gắn thẻ huỳnh quang, nó có thể được giảm thiểu đọc trên gel và đi qua một chùm tia laser để phát hiện bởi máy dò huỳnh quang. Để tránh các lỗi có thể phát sinh khi một trình tự được đọc bằng mắt và nhập thủ công vào máy tính, phương pháp này được phát triển thành việc sử dụng trình tự động ghép nối với máy tính.
Đây là phương pháp được sử dụng để giải trình tự DNA từ dự án Bộ gen người. Phương pháp này vẫn được sử dụng với các sửa đổi nâng cao vì nó cung cấp thông tin trình tự chính xác mặc dù là một quy trình tốn kém và chậm chạp.
Hình_2: Trình tự Sanger
Sự khác biệt giữa NGS và Sanger Sequencing là gì?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) đề cập đến các quy trình giải trình tự thông lượng cao hiện đại. Nó mô tả một số công nghệ giải trình tự hiện đại khác nhau | Sanger Sequencing là một phương pháp giải trình tự do Frederick Sanger phát triển để xác định thứ tự nucleotide chính xác của một đoạn DNA nhất định. |
| Hiệu quả về Chi phí | |
| NGS là một quy trình rẻ hơn vì nó giảm thời gian, sức người và hóa chất. | Đây là một quá trình tốn kém vì cần thời gian, sức người và nhiều hóa chất hơn. |
| Tốc độ | |
| Điều này nhanh hơn vì cả phát hiện hóa chất và phát hiện tín hiệu của nhiều sợi đều diễn ra song song. | Việc này tốn nhiều thời gian vì việc phát hiện hóa chất và phát hiện tín hiệu xảy ra như hai quá trình riêng biệt và chỉ trên sợi mới có thể đọc cùng một lúc. |
| Độ tin cậy | |
| NGS là đáng tin cậy. | Giải trình tự Sanger kém tin cậy hơn |
| Kích thước mẫu | |
| NGS yêu cầu lượng DNA ít hơn. | Phương pháp này cần một lượng lớn DNA mẫu. |
| Cơ sở DNA trên mỗi Phân đoạn Trình tự | |
| Số lượng cơ sở DNA trên mỗi đoạn được giải trình tự thấp hơn so với phương pháp Sanger | Trình tự tạo dài hơn trình tự NGS. |
Tóm tắt - Trình tự NGS vs Sanger
NGS và Sanger Sequencing là các kỹ thuật giải trình tự nucleotide được sử dụng rộng rãi trong Sinh học phân tử. Giải trình tự Sanger là một phương pháp giải trình tự ban đầu đã được thay thế bởi NGS. Sự khác biệt chính giữa NGS và Sanger Sequencing là NGS là một quá trình tốc độ cao, chính xác hơn và tiết kiệm chi phí hơn so với Sanger. Cả hai kỹ thuật đều tạo ra những đợt bùng phát lớn trong Di truyền và Công nghệ Sinh học.
