Sự khác biệt chính - Nhân bản gen và PCR
Quá trình tổng hợp nhiều bản sao DNA từ một đoạn DNA cụ thể được gọi là khuếch đại DNA. Có hai quá trình khuếch đại DNA chính là nhân bản gen và PCR. Sự khác biệt chính giữa nhân bản gen và PCR là, nhân bản gen tạo ra nhiều bản sao của một gen cụ thể in vivo bằng cách tạo ra một DNA tái tổ hợp và phát triển bên trong vi khuẩn chủ trong khi PCR tạo ra hàng triệu bản sao của một đoạn DNA cụ thể trong ống nghiệm trải qua các chu kỳ lặp lại của biến tính và tổng hợp.
Nhân bản gen là gì?
Nhân bản gen là một kỹ thuật được sử dụng để xác định vị trí và nhân lên một gen cụ thể từ DNA bộ gen được chiết xuất của một sinh vật thông qua việc xây dựng DNA tái tổ hợp. DNA bộ gen chứa hàng nghìn gen khác nhau được mã hóa cho protein. Khi DNA được chiết xuất, nó bao gồm tất cả các gen có thể có. Kỹ thuật nhân bản gen đã cho phép phát hiện một gen cụ thể từ tổng số DNA. Do đó, nhân bản gen đóng vai trò như một công cụ quan trọng trong sinh học phân tử.
Tạo thư viện bộ gen của một sinh vật là điều cần thiết trong quá trình nhân bản gen nếu không có manh mối về vị trí của gen liên quan trong DNA. Thư viện bộ gen được tạo bằng các bước sau.
Bước 1: Tách chiết tổng số DNA từ một sinh vật có chứa gen mong muốn.
Bước 2: Hạn chế phân hủy DNA đã tách chiết để tạo ra các đoạn nhỏ có thể quản lý được. Bước này được hỗ trợ bởi các endonucleases hạn chế.
Bước 3: Lựa chọn vectơ phù hợp và mở ADN vectơ bằng cách sử dụng cùng một endonucleaza giới hạn. Plasmid của vi khuẩn thường được sử dụng làm vectơ để mang DNA ngoại lai. Plasmid là những vòng tròn nhỏ của DNA nằm trong vi khuẩn.
Bước 4: Kết hợp DNA vector và DNA phân mảnh để tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp. Bước này được điều chỉnh bởi DNA ligase.
Bước 5: Chuyển phân tử DNA tái tổ hợp vào vi khuẩn vật chủ. Bước này được gọi là biến đổi và được thực hiện bằng cách sử dụng một cú sốc nhiệt.
Bước 5: Sàng lọc tế bào vi khuẩn đã biến nạp trên môi trường nuôi cấy. Một quần thể hỗn hợp gồm các tế bào chủ đã biến nạp và không bị biến đổi thu được khi kết thúc quá trình biến nạp. Vì gen quan tâm chỉ bao gồm trong các tế bào chủ được biến nạp. Do đó, cần phải chọn các tế bào được biến nạp. Việc lựa chọn được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh. Chỉ các tế bào được biến đổi mới phát triển trên phương tiện sàng lọc này cho phép lựa chọn.
Bước 6: Nuôi cấy vi khuẩn để tạo ra thư viện gen. Trong bước này, các tế bào vật chủ đã biến nạp được đưa vào môi trường nuôi cấy mới để cung cấp các yêu cầu tăng trưởng tối ưu. Tổng số khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy đại diện cho thư viện bộ gen của sinh vật đó.
Bước 7: Phân tử DNA tái tổ hợp có chứa gen quan tâm phải được sàng lọc từ hàng nghìn đoạn DNA tái tổ hợp được nhân bản. Nó có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các đầu dò đánh dấu gen cụ thể hoặc kết quả protein cụ thể từ gen đó.
Khi gen quan tâm chứa khuẩn lạc được xác định từ tổng số khuẩn lạc, có thể tạo ra hàng triệu bản sao của plasmid tái tổ hợp có chứa gen.
Nhân bản gen được sử dụng để thiết lập thư viện gen, sản xuất protein đặc biệt, vitamin, kháng sinh, hormone, giải trình tự và lập bản đồ bộ gen của các sinh vật, tạo nhiều bản sao DNA cá thể trong pháp y, v.v.
Hình_1: Nhân bản gen
PCR là gì?
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA cụ thể. Sự khuếch đại theo hàm mũ của một trình tự DNA cụ thể thu được bằng PCR trong điều kiện in vitro. Kỹ thuật này là một công cụ rất mạnh trong Sinh học phân tử vì nó có thể nhân một mẫu DNA nhỏ thành một lượng có thể sử dụng được. PCR được giới thiệu bởi Kary Mullis vào năm 1983 và phát minh đoạt giải này đã tạo ra một tiến bộ to lớn trong Sinh học Phân tử.
Kỹ thuật
PCR tuân theo các phản ứng PCR lặp đi lặp lại như trong Hình 02. Một phản ứng PCR bao gồm ba bước chính xảy ra ở ba nhiệt độ khác nhau; biến tính chuỗi kép ở DNA ở 940C, ủ mồi ở 680C và kéo dài sợi ở 720C. Do đó, khi thực hiện PCR, sự dao động nhiệt độ cần được duy trì ở mức cao để sao chép thích hợp. PCR được thực hiện trong một máy PCR bên trong các ống PCR. Các ống PCR được nạp các hỗn hợp PCR chính xác có chứa DNA khuôn mẫu, Taq polymerase, mồi, dNTP và đệm. Việc biến tính DNA mẫu sợi kép thành DNA sợi đơn được thực hiện bằng cách phá vỡ các liên kết hydro giữa các bazơ bổ sung ở 94 - 980C. Sau đó, các sợi đơn của DNA khuôn mẫu được tiếp xúc để lấy mồi. Cần cung cấp một cặp mồi (thuận và nghịch) và chúng phải có thể điều nhiệt để chịu được nhiệt độ cao. Mồi là các chuỗi DNA ngắn sợi đơn bổ sung cho các đầu của đoạn DNA đích. Mồi tổng hợp được sử dụng trong PCR. Các đoạn mồi liên kết với các bazơ bổ sung của DNA mẫu và bắt đầu tổng hợp một sợi mới. Bước này được xúc tác bởi một loại enzyme có tên là Taq polymerase; một enzyme DNA polymerase có khả năng điều nhiệt được phân lập từ Thermus auqaticus. Khi có sẵn mồi và nucleotide (khối xây dựng), Taq polymerase sẽ cấu tạo chuỗi DNA mới bổ sung cho DNA khuôn mẫu. Vào cuối chương trình PCR, đoạn DNA khuếch đại được quan sát bằng phương pháp điện di trên gel. Nếu cần phân tích thêm, sản phẩm PCR được tinh chế khỏi gel.
PCR rất hữu ích để chẩn đoán và theo dõi các bệnh di truyền và mắc phải, xác định tội phạm (trong lĩnh vực pháp y), nghiên cứu cấu trúc và chức năng của một đoạn DNA được nhắm mục tiêu, giải trình tự và lập bản đồ bộ gen của sinh vật, v.v … PCR đã trở thành một kỹ thuật phòng thí nghiệm thông thường trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu y học và sinh học phân tử giữa các nhà khoa học vì nó có nhiều ứng dụng.
Hình_2: Phản ứng Chuỗi Polymerase
Sự khác biệt giữa Nhân bản gen và PCR là gì?
Nhân bản gen so với PCR |
|
| Nhân bản gen là quá trình tạo ra nhiều bản sao của một gen cụ thể in vivo thông qua DNA tái tổ hợp và biến đổi thành vi khuẩn chủ. | Kỹ thuật PCR tạo ra nhiều bản sao của một chuỗi DNA cụ thể trong ống nghiệm thông qua các chu kỳ lặp lại của phản ứng PCR. |
| Yêu cầu cấu tạo DNA tái tổ hợp | |
| DNA tái tổ hợp được tạo ra để định vị gen. | DNA tái tổ hợp không được tạo ra. |
| Cần lao động | |
| Quá trình này tốn nhiều công sức. | Không cần lao động chuyên sâu. |
| Quy trình in vivo hoặc In vitro | |
| Việc xây dựng DNA tái tổ hợp là trong ống nghiệm và quá trình khuếch đại DNA là in vivo. | Quá trình khuếch đại DNA diễn ra hoàn toàn trong ống nghiệm. |
Tóm tắt - Nhân bản gen vs PCR
Nhân bản gen và PCR là hai phương pháp được sử dụng để khuếch đại DNA. PCR là một quá trình in vitro tạo ra nhiều bản sao DNA của một đoạn DNA cụ thể mà không sử dụng DNA tái tổ hợp và sinh vật chủ. Nhân bản gen chủ yếu là một quá trình in vivo tạo ra nhiều bản sao của một gen quan tâm bên trong cơ thể vật chủ thông qua việc xây dựng DNA tái tổ hợp. Đây là sự khác biệt giữa nhân bản gen và PCR.
