Sự khác biệt chính - PCR và giải trình tự DNA
PCR và giải trình tự DNA là hai kỹ thuật quan trọng trong Sinh học phân tử. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là quá trình tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA. Giải trình tự DNA là kỹ thuật dẫn đến thứ tự chính xác của các nucleotide của một đoạn DNA nhất định. Đây là điểm khác biệt chính giữa PCR và xác định trình tự DNA. PCR là một trong những bước quan trọng liên quan đến giải trình tự DNA.
PCR là gì?
Polymerase Chain Reaction (PCR) là một kỹ thuật khuếch đại DNA được sử dụng trong Sinh học Phân tử. Nó tạo ra hàng nghìn đến hàng triệu bản sao của một đoạn DNA cụ thể. Phương pháp này được phát triển bởi Kary Mullis vào năm 1983. Trong kỹ thuật này, đoạn DNA được khuếch đại đóng vai trò như khuôn mẫu và enzyme DNA polymerase bổ sung nucleotide bổ sung vào đoạn mồi có sẵn trong hỗn hợp PCR. Khi kết thúc phản ứng PCR, nhiều bản sao của DNA mẫu được tổng hợp.
Có các thành phần khác nhau của hỗn hợp PCR, bao gồm DNA, DNA polymerase (Taq polymerase), các đoạn mồi (mồi thuận và nghịch), nucleotide (các khối cấu tạo của DNA) và một bộ đệm. PCR xảy ra bên trong máy PCR, và hỗn hợp PCR chính xác phải được nạp vào máy và chạy đúng chương trình. Kỹ thuật này cho phép sản xuất hàng nghìn đến hàng triệu bản sao của một đoạn DNA cụ thể từ một lượng rất nhỏ DNA.
Phản ứng PCR xảy ra theo chu kỳ để tạo ra lượng sản phẩm PCR có thể nhìn thấy trên gel. Có ba bước chính liên quan đến phản ứng PCR là biến tính, ủ mồi và kéo dài sợi như trong Hình 01. Ba bước này xảy ra ở ba nhiệt độ khác nhau. DNA tồn tại ở dạng sợi kép nhờ các liên kết hydro giữa các base bổ sung. Trước khi có ý nghĩa, DNA sợi kép nên được tách ra khỏi nhau. Nó được thực hiện bằng cách cho một nhiệt độ cao. Ở nhiệt độ cao, DNA sợi kép biến tính thành các sợi đơn. Sau đó, các đoạn mồi sẽ đến gần các đầu bên của đoạn cụ thể hoặc gen của DNA. Mồi là một đoạn ngắn của DNA sợi đơn bổ sung cho trình tự đích. Các đoạn mồi thuận và nghịch được ủ với các bazơ bổ sung ở hai đầu bên của DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ ủ. Lớp sơn lót nên có khả năng chịu nhiệt. Khi mồi được ủ với DNA mẫu, enzyme taq polymerase sẽ bắt đầu tổng hợp các sợi mới bằng cách thêm nucleotide bổ sung cho DNA đích. Taq polymerase là một enzym bền nhiệt được phân lập từ vi khuẩn ưa nhiệt có tên là Thermus aquus. Bộ đệm PCR duy trì các điều kiện tối ưu cho hoạt động của taq polymerase. Ba giai đoạn này của phản ứng PCR được lặp lại để tạo ra lượng sản phẩm PCR cần thiết. Sau mỗi phản ứng PCR, số lượng bản sao DNA tăng lên gấp đôi. Do đó, có thể quan sát thấy sự khuếch đại theo hàm mũ trong PCR. Sản phẩm PCR có thể được quan sát bằng cách sử dụng điện di trên gel và có thể được tinh chế để nghiên cứu thêm.
Hình 01: Các bước chính của phản ứng PCR
PCR là một công cụ có giá trị trong nghiên cứu y học và sinh học. PCR có một giá trị đặc biệt trong khoa học pháp y vì nó có thể khuếch đại DNA cho các nghiên cứu từ các mẫu nhỏ của tội phạm và tạo hồ sơ DNA pháp y. PCR được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sinh học phân tử bao gồm định dạng gen, nhân bản gen, phát hiện đột biến, giải trình tự ADN, vi mạch ADN và xét nghiệm quan hệ cha con, v.v.
Hình 02: Phản ứng chuỗi polymerase
Giải trình tự DNA là gì?
Giải trình tự DNA là xác định thứ tự chính xác của các nucleotide - adenine, guanine, cytosine và thymine trong một đoạn DNA nhất định. Thông tin di truyền được lưu trữ trong trình tự DNA bằng cách sử dụng thứ tự chính xác của các nucleotide. Do đó, việc tìm ra thứ tự chính xác của các nucleotide trong một đoạn DNA là rất quan trọng để biết về cấu trúc và chức năng của các gen.
Giao thức giải trình tự DNA liên quan đến các quy trình khác nhau. Bước đầu tiên là phân lập DNA quan tâm hoặc DNA bộ gen của một sinh vật. Sử dụng PCR (như mô tả ở trên), vùng mong muốn của DNA sẽ được khuếch đại. Sản phẩm PCR khuếch đại phải được phân tách bằng điện di trên gel và được tinh chế. Các đoạn khuếch đại được dùng làm khuôn mẫu để giải trình tự. Việc giải trình tự có thể được thực hiện theo phương pháp giải trình tự Sanger hoặc phương pháp giải trình tự thông lượng cao. Giải trình tự sang hơn đòi hỏi điện di mao quản của các đoạn DNA thu được. Việc xác định thứ tự nucleotide chính xác có thể được thực hiện bằng cách đọc thủ công các bản ký tự hoặc sử dụng trình tự động DNA.
Giải trình tự gen đã đóng góp vào dự án Bộ gen người và tạo điều kiện thuận lợi cho việc lập bản đồ bộ gen người vào năm 2003. Trong pháp y, giải trình tự ADN cho phép xác định các cá nhân hiển thị các trình tự ADN duy nhất và xác định tội phạm. Trong y học, giải trình tự DNA có thể được sử dụng để phát hiện các gen chịu trách nhiệm về di truyền và các bệnh khác, tìm ra các gen khiếm khuyết và thay thế chúng bằng các gen chính xác. Trong nông nghiệp, thông tin trình tự DNA của một số vi sinh vật được sử dụng để tạo ra cây trồng chuyển gen với các đặc điểm kinh tế mong muốn.
Hình 03: Trình tự DNA
Sự khác biệt giữa PCR và Giải trình tự DNA là gì?
PCR vs Giải trình tự DNA |
|
| Quy trình PCR tạo ra hàng nghìn đến hàng triệu bản sao của đoạn DNA quan tâm. | Giải trình tự DNA là quá trình xác định thứ tự chính xác của các nucleotide trong một đoạn DNA nhất định. |
| Kết quả | |
| PCR tạo ra hàng nghìn đến hàng triệu bản sao của một đoạn DNA cụ thể | Điều này dẫn đến thứ tự chính xác của các bazơ trong một đoạn DNA cụ thể. |
| Sự tham gia của ddNTPs | |
| PCR không yêu cầu ddNTPs. Nó sử dụng dNTPs. | Giải trình tự DNA yêu cầu ddNTPs để chấm dứt sự hình thành sợi. |
Tóm tắt - PCR vs Giải trình tự DNA
PCR và giải trình tự DNA là những công cụ rất quan trọng trong nhiều lĩnh vực của Sinh học Phân tử. Khuếch đại các đoạn DNA được thực hiện bằng kỹ thuật PCR trong khi thứ tự chính xác của các nucleotide của một đoạn DNA được xác định bằng trình tự DNA. Đây là sự khác biệt giữa PCR và giải trình tự DNA.
