Sự khác biệt chính - Sắp xếp theo trình tự Sanger so với Kết cấu bằng đường hỏa hoạn
Giải trình tự DNA rất quan trọng đối với phân tích DNA vì kiến thức về sự sắp xếp các nucleotide chính xác trên một vùng DNA cụ thể cho thấy nhiều thông tin quan trọng về nó. Có nhiều phương pháp giải trình tự DNA khác nhau. Giải trình tự Sanger và Pyrosequencing là hai phương pháp giải trình tự DNA khác nhau được sử dụng rộng rãi trong Sinh học phân tử. Sự khác biệt cơ bản giữa giải trình tự Sanger và Pyrosequencing là giải trình tự Sanger sử dụng dideoxynucleotide để chấm dứt quá trình tổng hợp DNA để đọc trình tự nucleotide trong khi giải pyrosequencing phát hiện sự giải phóng pyrophosphate bằng cách kết hợp các nucleotide và tổng hợp trình tự bổ sung để đọc thứ tự chính xác của trình tự.
Sanger Sequencing là gì?
Sanger giải trình tự là một phương pháp giải trình tự DNA thế hệ đầu tiên được phát triển bởi Frederick Sanger và các trường đại học của ông vào năm 1977. Nó còn được gọi là Chuỗi kết thúc chuỗi hoặc giải trình tự Dideoxy vì nó dựa trên sự kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotides (ddNTPs). Phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 năm cho đến khi Giải trình tự thế hệ mới (NGS) được phát triển. Kỹ thuật giải trình tự Sanger cho phép phát hiện ra thứ tự nucleotide chính xác hoặc sự gắn vào một đoạn DNA cụ thể. Nó dựa trên sự kết hợp có chọn lọc các ddNTP và kết thúc quá trình tổng hợp DNA trong quá trình sao chép DNA trong ống nghiệm. Sự vắng mặt của các nhóm 3’OH để tiếp tục hình thành liên kết phosphodiester giữa các nucleotide liền kề là một đặc điểm riêng của ddNTPs. Do đó, một khi ddNTP được gắn vào, quá trình kéo dài chuỗi chấm dứt và chấm dứt từ thời điểm đó. Có bốn ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP và ddTTP - được sử dụng trong giải trình tự Sanger. Các nucleotide này ngăn quá trình sao chép DNA khi chúng được kết hợp vào chuỗi DNA đang phát triển và dẫn đến các đoạn DNA dài ngắn khác nhau. Điện di trên gel mao dẫn được sử dụng để sắp xếp các sợi DNA ngắn này theo kích thước của chúng trên gel như trong Hình 01.
Hình 1: Điện di trên gel mao quản của DNA ngắn tổng hợp
Để sao chép DNA trong ống nghiệm, cần cung cấp một số yêu cầu. Chúng là enzyme DNA polymerase, DNA khuôn mẫu, mồi oligonucleotide và deoxynucleotide (dNTPs). Trong giải trình tự Sanger, quá trình sao chép DNA được thực hiện trong bốn ống nghiệm riêng biệt cùng với bốn loại ddNTP riêng biệt. Các deoxynucleotide không được thay thế hoàn toàn bằng các ddNTP tương ứng. Một hỗn hợp của dNTP cụ thể (ví dụ: dATP + ddATP) được bao gồm trong ống và sao chép. Bốn sản phẩm dạng ống riêng biệt được chạy trên gel trong bốn giếng riêng biệt. Sau đó, bằng cách đọc gel, trình tự có thể được xây dựng như trong Hình 02.
Hình 02: Giải trình tự Sanger
Giải trình tựSanger là một kỹ thuật quan trọng giúp ích trong nhiều lĩnh vực sinh học phân tử. Dự án bộ gen người đã được hoàn thành thành công với sự hỗ trợ của các phương pháp dựa trên giải trình tự Sanger. Giải trình tự Sanger cũng hữu ích trong giải trình tự DNA mục tiêu, nghiên cứu ung thư và bệnh di truyền, phân tích biểu hiện gen, xác định người, phát hiện mầm bệnh, giải trình tự vi sinh vật, v.v.
Có một số nhược điểm của giải trình tự Sanger:
- Chiều dài của DNA được giải trình tự không được dài hơn 1000 cặp bazơ
- Chỉ có thể trình tự một sợi tại một thời điểm.
- Quá trình này tốn nhiều thời gian và tốn kém.
Vì vậy, các kỹ thuật giải trình tự tiên tiến mới đã được phát triển cùng với thời gian để khắc phục những vấn đề này. Tuy nhiên, giải trình tự Sanger vẫn được sử dụng do kết quả có độ chính xác cao lên đến khoảng 850 đoạn có độ dài cặp cơ sở.
Pyrosequencing là gì?
Pyrosequencing là một kỹ thuật giải trình tự DNA mới dựa trên "giải trình tự bằng tổng hợp". Kỹ thuật này dựa vào việc phát hiện sự giải phóng pyrophosphat khi kết hợp nucleotide. Quá trình này được sử dụng bởi bốn loại enzyme khác nhau: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase và hai chất nền adenosine 5’phosphosulfate (APS) và luciferin.
Quá trình bắt đầu với sự gắn mồi với khuôn mẫu DNA sợi đơn và DNA polymerase bắt đầu kết hợp các nucleotide bổ sung cho nó. Khi các nucleotide liên kết với nhau (trùng hợp axit nucleic), nó sẽ giải phóng pyrophosphate (hai nhóm phosphate liên kết với nhau) và năng lượng. Mỗi lần bổ sung nucleotide sẽ giải phóng một lượng pyrophosphate bằng nhau. Pyrophosphat chuyển hóa thành ATP nhờ ATP sulfurylase khi có mặt APS cơ chất. ATP được tạo ra thúc đẩy quá trình chuyển đổi luciferin thành oxyluciferin qua trung gian luciferase, tạo ra ánh sáng nhìn thấy với số lượng tỷ lệ với số lượng ATP. Ánh sáng được phát hiện bởi một thiết bị phát hiện photon hoặc bằng ống nhân quang và tạo ra một biểu đồ. Apyrase phân hủy ATP và các dNTP không kết hợp trong hỗn hợp phản ứng. Việc bổ sung dNTP được thực hiện một lần tại một thời điểm. Vì sự bổ sung nucleotide được biết đến tùy theo sự kết hợp và phát hiện ánh sáng, nên trình tự của khuôn mẫu có thể được xác định. Pyrogram được sử dụng để tạo ra trình tự nucleotide của DNA mẫu như thể hiện trong Hình 03.
Pyrosequencing là rất quan trọng trong phân tích đa hình nucleotide đơn và giải trình tự các đoạn ngắn của DNA. Độ chính xác cao, tính linh hoạt, dễ dàng tự động hóa và xử lý song song là những ưu điểm của giải trình tự pyrose so với kỹ thuật giải trình tự Sanger.
Hình 03: Kết quả bằng đường hỏa hoạn
Sự khác biệt giữa Lập trình tự Sanger và Lập trình tự bằng Pyrose là gì?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Giải trình tự Sanger là một phương pháp giải trình tự DNA dựa trên sự kết hợp có chọn lọc các ddNTP bằng DNA polymerase và kết thúc chuỗi. | Pyrosequencing là một phương pháp giải trình tự DNA dựa trên việc phát hiện giải phóng pyrophosphate khi kết hợp nucleotide. |
| Sử dụng ddNTP | |
| ddNTPs được sử dụng để chấm dứt quá trình sao chép DNA | ddNTP không được sử dụng. |
| Enzyme tham gia | |
| DNA polymerase được sử dụng. | Bốn enzym được sử dụng: DNA polymerase, ATP sulfurylase, Luciferase và Apyrase. |
| Chất nền được sử dụng | |
| APS và Luciferin không được sử dụng. | Adenosine 5’phosphosulfate (APS) và luciferin được sử dụng. |
| Nhiệt độ tối đa | |
| Đây là một quá trình chậm. | Đây là một quá trình nhanh chóng. |
Tóm tắt - Sắp xếp theo trình tự Sanger và Lập trình tự bằng lửa
Sanger sequencing và Pyrosequencing là hai phương pháp giải trình tự DNA được sử dụng trong sinh học phân tử. Giải trình tự Sanger xây dựng thứ tự của các nucleotide trong trình tự bằng cách chấm dứt sự kéo dài chuỗi trong khi giải trình tự pyrose xây dựng thứ tự chính xác của các nucleotide trong trình tự bằng cách kết hợp các nucleotide và phát hiện sự giải phóng pyrophosphat. Do đó, sự khác biệt chính giữa giải trình tự Sanger và Pyrosequencing là trình tự Sanger hoạt động dựa trên việc giải trình tự bằng cách kết thúc chuỗi trong khi giải trình tự pyrose hoạt động trên việc giải trình tự bằng cách tổng hợp.
