Sự khác biệt chính - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nucleotide là đơn vị cấu trúc cơ bản và các khối xây dựng của DNA. Phân tử DNA được cấu tạo bởi một chuỗi polynucleotide. Có bốn nucleotide khác nhau được tìm thấy trong DNA. Các nucleotide này được cấu tạo từ bốn gốc nitơ khác nhau có tên là A (adenine), G (guanine), C (cytosine), T (thymine). Thứ tự của các nucleotide trong phân tử DNA có một tầm quan trọng lớn vì nó mã hóa một thông tin di truyền quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật. Giải trình tự DNA đề cập đến quá trình xác định trình tự nucleotide chính xác của DNA. Có nhiều phương pháp giải trình tự DNA khác nhau. Giải trình tự Maxam Gilbert và giải trình tự DNA Sanger là hai phương pháp giải trình tự DNA thuộc về giải trình tự thế hệ thứ nhất. Quy trình giải trình tự Maxam Gilbert xác định trình tự cơ sở bằng cách phân cắt ưu tiên các đoạn DNA được đánh dấu đầu 5’về mặt hóa học ở mỗi bốn nucleotide và điện di trên gel. Quy trình giải trình tự Sanger xác định trình tự nucleotide bằng cách tổng hợp DNA sợi đơn bằng cách sử dụng DNA polymerase và dideoxynucleotides và điện di trên gel. Đây là điểm khác biệt chính giữa Maxam Gilbert và Sanger Sequencing.
Maxam Gilbert Sequencing là gì?
Maxam Gilbert giải trình tự, còn được gọi là phương pháp giải trình tự hóa học, là một kỹ thuật được phát triển để xác định thứ tự của các nucleotide trong DNA. Phương pháp này được W alter Gilbert và Alan Maxam giới thiệu vào năm 1976 và trở nên phổ biến vì nó có thể được thực hiện trực tiếp với DNA tinh khiết. Phương pháp Maxam Gilbert thuộc thế hệ đầu tiên của phương pháp giải trình tự DNA, và nó là phương pháp giải trình tự đầu tiên được các nhà khoa học sử dụng rộng rãi.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này nằm ở việc hạn chế các đoạn DNA được đánh dấu cuối ở các cơ sở cụ thể bằng các hóa chất và điều kiện cụ thể dành cho cơ sở và tách các đoạn được đánh dấu bằng điện di như trong hình 01. Các đoạn được phân tách theo kích thước của chúng trên gel. Vì các đoạn được đánh dấu, nên có thể dễ dàng suy ra trình tự của phân tử DNA.
Maxam gilbert phương pháp sử dụng các hóa chất đặc biệt cơ bản để phá vỡ DNA tại các cơ sở cụ thể. Hai hóa chất phổ biến có tên là hóa chất dimethyl sulphat và hydrazine được sử dụng để tấn công chọn lọc các chất purin và pyrimidine tương ứng.
Phương pháp giải trình tự Maxam Gilbert được thực hiện qua một số bước như sau.
- Thanh lọc chuỗi DNA bằng cách sử dụng endonucleases giới hạn
- Dán nhãn cho các đầu của đoạn DNA bằng cách thêm phốt phát phóng xạ
- Làm sạch các mảnh có nhãn từ các mảnh không được dán nhãn bằng điện di trên gel
- Tách DNA được đánh dấu cuối thành bốn ống và xử lý riêng biệt bằng các hóa chất cơ bản đặc biệt
- Điện di các thành phần trong mỗi ống trên các dòng riêng biệt trên gel và phân tách mảnh theo chiều dài của chúng.
- Phát hiện các mảnh vỡ bằng chữ ký.
Hình 01: Trình tự Maxam Gilbert
Sanger Sequencing là gì?
Sanger Sequencing là một phương pháp giải trình tự được phát triển bởi Frederick Sanger và các đồng nghiệp của ông vào năm 1977 để xác định trình tự cơ sở của một đoạn DNA nhất định. Nó còn được gọi là phương pháp giải trình tự kết thúc chuỗi hoặc phương pháp giải trình tự Dideoxy. Phương pháp này hoạt động trên nguyên tắc kết hợp có chọn lọc các dideoxynucleotide kết thúc chuỗi (ddNTPs) như ddGTP, ddCTP, ddATP và ddTTP bởi DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA sợi đơn để chấm dứt sự hình thành sợi. Dideoxynucleotide thiếu nhóm OH 3’để hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide liền kề. Do đó, sự hình thành sợi sẽ dừng lại khi ddNTP được kết hợp vào sợi mới hình thành trong quá trình giải trình tự sanger.
Trong phương pháp này, bốn phản ứng tổng hợp DNA riêng biệt (PCR) được thực hiện trong bốn ống riêng biệt với một loại ddNTP. Các yêu cầu khác cũng được cung cấp cho các ống cho PCR bao gồm mồi, dNTPs, Taq polymerase, các điều kiện cụ thể, v.v. Bốn phản ứng riêng biệt được thực hiện trong bốn ống với bốn hỗn hợp. Sau phản ứng PCR, các đoạn DNA tạo thành được biến tính nhiệt và tách ra bằng điện di trên gel. Sau đó, các mảnh vỡ được hình dung bằng cách sử dụng mồi hoặc dNTP được dán nhãn (phóng xạ hoặc huỳnh quang) như trong hình 02.
Hình 02: Trình tự Sanger
Sự khác biệt giữa Maxam Gilbert và Sanger Sequencing là gì?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Giải trình tự Maxam Gilbert là kỹ thuật đầu tiên được phát triển để giải trình tự DNA. | Phương pháp giải trình tự Sanger được giới thiệu sau phương pháp giải trình tự Maxam Gilbert. |
| Cách sử dụng | |
| Phương pháp này hiếm khi được sử dụng. | Giải trình tự Sanger thường được sử dụng để giải trình tự. |
| Sử dụng Hóa chất Nguy hiểm | |
| Nó sử dụng hóa chất độc hại. | Hạn chế sử dụng hóa chất độc hại so với phương pháp Maxam Gilbert. |
| Dán nhãn để phát hiện | |
| Phương pháp này sử dụng phóng xạ P32để ghi nhãn các đầu của đoạn DNA. | Giải trình tự Sanger sử dụng ddNTP được gắn nhãn phóng xạ hoặc huỳnh quang. |
Tóm tắt - Xếp thứ tự Maxam Gilbert vs Sanger
Maxam Gilbert và giải trình tự Sanger là hai loại kỹ thuật giải trình tự DNA thuộc giải trình tự DNA thế hệ đầu tiên. Giải trình tự Maxam Gilbert là phương pháp đầu tiên được giới thiệu để giải trình tự DNA vào năm 1976, và nó được thực hiện bằng cách phá vỡ các đoạn DNA được đánh dấu cuối bằng các hóa chất đặc trưng cho base. Do đó, nó được gọi là giải trình tự hóa học. Phương pháp giải trình tự Sanger được giới thiệu vào năm 1977, và dựa trên các phản ứng kết thúc chuỗi điều khiển ddNTP. Phương pháp giải trình tự Sanger phổ biến hơn phương pháp Maxam Gilbert do một số nhược điểm của phương pháp Maxam Gilbert như tiêu tốn quá nhiều thời gian, sử dụng hóa chất nguy hiểm, v.v. Đây là sự khác biệt giữa giải trình tự Maxam Gilbert và Sanger.
