Sự khác biệt chính - RT PCR và QPCR
Polymerase Chain Reaction là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một vùng DNA cụ thể trong ống nghiệm. Do Kary Mullis phát minh ra kỹ thuật này vào năm 1983, các nhà khoa học có thể tạo ra hàng nghìn đến hàng triệu bản sao của các đoạn DNA cụ thể cho các mục đích nghiên cứu. Hiện nay, nó đã trở thành một kỹ thuật phổ biến và được thực hiện thường xuyên trong các phòng thí nghiệm lâm sàng và nghiên cứu cho nhiều ứng dụng khác nhau. Có nhiều biến thể của kỹ thuật PCR truyền thống như RT PCR, PCR lồng nhau, PCR ghép kênh, Q PCR, RT - QPCR, vv RT PCR và Q PCR là hai biến thể quan trọng của PCR. Sự khác biệt chính giữa RT PCR và Q PCR là RT PCR được sử dụng để phát hiện biểu hiện gen thông qua việc tạo ra các bản sao DNA bổ sung (cDNA) từ RNA trong khi Q PCR được sử dụng để đo định lượng các sản phẩm PCR theo thời gian thực bằng cách sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang.
RT PCR là gì?
Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT PCR) là một biến thể của PCR được sử dụng để phát hiện biểu hiện RNA. Đây là một phương pháp rất quan trọng để phát hiện biểu hiện mRNA trong các mô. RT PCR được sử dụng khi nguyên liệu ban đầu của mẫu là RNA. Trong RT PCR, mRNA của khuôn mẫu lần đầu tiên được chuyển đổi thành DNA bổ sung. Bước này được xúc tác bởi enzym phiên mã ngược và quá trình này được gọi là phiên mã ngược. Thứ hai, PCR truyền thống được sử dụng cho cDNA mới được tổng hợp để khuếch đại.
RT PCR là một kỹ thuật có độ nhạy cao, cần một lượng mẫu RNA tương đối nhỏ. RT PCR thường được sử dụng trong chẩn đoán và định lượng các loài RNA, đặc biệt là virus RNA như virus suy giảm miễn dịch ở người và virus viêm gan C.
Hình 01: Kỹ thuật RT PCR
QPCR là gì?
PCR Định lượng (QPCR) là một biến thể của PCR được sử dụng để đo định lượng các sản phẩm PCR. Nó còn được gọi là phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực vì nó đo độ khuếch đại của thời gian thực bằng cách sử dụng máy PCR thời gian thực. Đây là một phương pháp thích hợp để xác định số lượng trình tự hoặc gen mục tiêu có trong mẫu. Tính năng thú vị của QPCR là nó kết hợp cả khuếch đại và định lượng thực vào một bước duy nhất. Do đó, nhu cầu điện di trên gel trong phát hiện có thể được loại bỏ bằng kỹ thuật QPCR. QPCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang để dán nhãn các sản phẩm PCR trong quá trình phản ứng PCR mà cuối cùng dẫn đến định lượng trực tiếp. Khi các sản phẩm PCR tích tụ, các tín hiệu huỳnh quang cũng được tích lũy và nó sẽ được đo bằng máy thời gian thực. QPCR có thể được kết hợp với RT PCR. Nó được gọi là RT-QPCR hoặc QRT-PCR và được coi là một phương pháp định lượng, nhạy và mạnh nhất để phát hiện mức RNA trong tế bào hoặc mô.
SYBR Green và Taqman là hai phương pháp được sử dụng để phát hiện hoặc theo dõi quá trình khuếch đại của PCR thời gian thực. Phương pháp SYBR Green được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là SYBR xanh và phát hiện sự khuếch đại bằng cách liên kết thuốc nhuộm để tạo ra DNA sợi đôi. Taqman được thực hiện bằng cách sử dụng các đầu dò có nhãn kép và phát hiện sự khuếch đại bằng cách suy thoái đầu dò bởi Taq polymerase và giải phóng fluorophore như trong hình 02. Cả hai phương pháp đều theo dõi tiến trình của quá trình khuếch đại và báo cáo số lượng sản phẩm theo thời gian thực.
Real time PCR có nhiều ứng dụng như định lượng biểu hiện gen, phân tích microRNA và RNA không mã hóa, định kiểu gen SNP, phát hiện các biến thể số bản sao, phát hiện các đột biến hiếm gặp, phát hiện sinh vật biến đổi gen, phát hiện các tác nhân lây nhiễm, v.v.
Hình 02: Kỹ thuật PCR định lượng
Sự khác biệt giữa RT PCR và QPCR là gì?
RT PCR so với QPCR |
|
| RT PCR là một kỹ thuật được sử dụng để phát hiện biểu hiện gen bằng cách khuếch đại. | QPCR là một kỹ thuật khuếch đại DNA và định lượng các sản phẩm PCR trong thời gian thực. |
| Sự tham gia của Enzyme phiên mã ngược | |
| Enzyme phiên mã ngược được sử dụng cho RT PCR. | Enzyme phiên mã ngược không được sử dụng cho QPCR. |
| Sử dụng các phân tử được gắn nhãn huỳnh quang | |
| Thuốc nhuộm hoặc đầu dò được dán nhãn huỳnh quang không được sử dụng cho RT PCR. | Thuốc nhuộm hoặc đầu dò có nhãn huỳnh quang được sử dụng cho QPCR. |
| Định lượng sản phẩm PCR | |
| Trừ khi được kết hợp với QPCR, RT PCR không định lượng sản phẩm PCR. | QPCR đo lường định lượng sản phẩm PCR. |
| Nguyên liệu ban đầu | |
| Nguyên liệu ban đầu là mRNA. | Nguyên liệu ban đầu là DNA. |
| Tổng hợp cDNA | |
| DNA bổ sung được tạo ra trong RT PCR. | DNA bổ sung không được tạo ra trong QPCR. |
Tóm tắt - RT PCR vs QPCR
RT PCR và QPCR là hai phiên bản của PCR truyền thống. Kỹ thuật RT PCR được thực hiện cho các mẫu mRNA và nó được điều khiển bởi quá trình phiên mã ngược và sản xuất cDNA. QPCR được sử dụng để định lượng các sản phẩm PCR trong chu kỳ nhiệt PCR thời gian thực bằng cách sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc đầu dò được dán nhãn. Trong QPCR, lượng sản phẩm PCR được biểu thị bằng các tín hiệu huỳnh quang được phát ra bởi mẫu. RT PCR được sử dụng phổ biến như một quá trình khuếch đại trong khi QPCR thường được sử dụng như một quá trình định lượng. Đây là sự khác biệt giữa RT PCR và QPCR.
