Sự khác biệt chính giữa xét nghiệm PCR lồng nhau thông thường và xét nghiệm PCR thời gian thực là PCR thông thường là một kỹ thuật được phát triển để khuếch đại các trình tự cụ thể của DNA và PCR lồng nhau là một sửa đổi của PCR thông thường bao gồm hai phản ứng khuếch đại tuần tự, trong khi thực -time PCR là một biến thể của PCR thông thường có thể định lượng sản phẩm khuếch đại.
PCR là một kỹ thuật khoa học rất phổ biến được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và y học để phát hiện DNA. Xét nghiệm PCR được sử dụng để phát hiện kháng nguyên bằng cách phát hiện DNA hoặc RNA của chúng. Nói chung, RNA của virus hiện diện trong cơ thể trước khi phát hiện ra kháng thể hoặc biểu hiện các triệu chứng của bệnh. Xét nghiệm PCR có thể cho biết liệu ai đó có nhiễm vi rút sớm hay không. Hiện nay, PCR là xét nghiệm tiêu chuẩn để phát hiện bệnh COVID-19. Có nhiều loại kỹ thuật PCR khác nhau như PCR thời gian thực, PCR lồng nhau, PCR ghép kênh, PCR khởi động nóng và PCR tầm xa, v.v.
Xét nghiệm PCR Thông thường là gì?
Xét nghiệm PCR thông thường là một kỹ thuật khuếch đại DNA trong ống nghiệm được thực hiện thường xuyên trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Phương pháp này cho phép sản xuất hàng nghìn đến hàng triệu bản sao của một đoạn DNA cụ thể. Kary Mullis đã giới thiệu kỹ thuật này vào năm 1980. Kỹ thuật này yêu cầu một đoạn DNA được gọi là khuôn mẫu để tạo ra nhiều bản sao của nó. Taq polymerase hoạt động như enzyme DNA polymerase và xúc tác tổng hợp các sợi mới của chuỗi khuôn mẫu.
Các mồi trong hỗn hợp PCR sẽ hoạt động như điểm khởi đầu cho các phần mở rộng phân mảnh. Tất cả các thành phần cần thiết để tạo bản sao của DNA đều có trong hỗn hợp PCR. Phản ứng PCR được chạy trong máy PCR và nó phải được cung cấp hỗn hợp PCR chính xác và chương trình PCR phù hợp. Nếu hỗn hợp phản ứng và chương trình chính xác, nó sẽ tạo ra số lượng bản sao cần thiết của một đoạn DNA cụ thể từ một lượng rất nhỏ DNA.
Hình 01: Xét nghiệm PCR thông thường
Có ba bước chính liên quan đến phản ứng PCR: biến tính, ủ mồi và kéo dài sợi. Ba bước này xảy ra ở ba nhiệt độ khác nhau. Bộ đệm PCR duy trì các điều kiện tối ưu cho hoạt động của Taq polymerase. Ba giai đoạn này của phản ứng PCR được lặp lại để tạo ra lượng sản phẩm PCR cần thiết. Ở mỗi phản ứng PCR, số lượng bản sao DNA tăng gấp đôi. Do đó, sự khuếch đại theo hàm mũ có thể được quan sát thấy trong PCR. Sản phẩm PCR có thể được phân giải bằng cách sử dụng điện di trên gel vì nó tạo ra một lượng DNA có thể nhìn thấy được trên gel và nó có thể được tinh chế cho các nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự.
PCR là một công cụ có giá trị trong nghiên cứu y học và sinh học. Đặc biệt trong các nghiên cứu pháp y, PCR có một giá trị to lớn vì nó có thể khuếch đại DNA cho các nghiên cứu từ các mẫu nhỏ của tội phạm và tạo hồ sơ DNA pháp y. PCR được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sinh học phân tử bao gồm định dạng kiểu gen, nhân bản gen, phát hiện đột biến, xác định trình tự DNA, vi mạch DNA và xét nghiệm quan hệ cha con.
Xét nghiệm PCR lồng nhau là gì?
PCR lồng nhau là một loại PCR làm giảm sự khuếch đại không đặc hiệu của DNA. Có hai phản ứng PCR kế tiếp hoặc hai phản ứng khuếch đại tuần tự trong xét nghiệm PCR lồng nhau. Trong phản ứng khuếch đại đầu tiên, một sản phẩm PCR được tạo ra. Sau phản ứng đầu tiên, phản ứng khuếch đại thứ hai được thực hiện trên sản phẩm PCR của phản ứng đầu tiên. Do đó, mồi trong hỗn hợp phản ứng thứ hai liên kết với sản phẩm PCR đầu tiên và khuếch đại nó.
Hình 02: PCR lồng nhau
Các cặp mồi khác nhau trong mỗi phản ứng. Sự liên kết không đặc hiệu của mồi bị giảm trong PCR lồng nhau. Các xét nghiệm PCR lồng nhau rất hữu ích để tăng độ nhạy và / hoặc độ đặc hiệu. Tuy nhiên, PCR lồng nhau yêu cầu kiến thức về trình tự quan tâm.
Xét nghiệm PCR Thời gian thực là gì?
PCR thời gian thực hoặc PCR định lượng (Q PCR) là một phiên bản PCR được sửa đổi để đo định lượng các sản phẩm PCR. Do đó, kỹ thuật này định lượng độ khuếch đại trong thời gian thực bằng máy PCR thời gian thực. Đây cũng là một phương pháp thích hợp để xác định số lượng trình tự hoặc gen đích có trong mẫu.
Tính năng thú vị của PCR thời gian thực là nó kết hợp cả khuếch đại và định lượng thực vào một bước duy nhất. Do đó, nhu cầu điện di trên gel để phát hiện có thể được loại bỏ bằng kỹ thuật PCR thời gian thực. Việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang để dán nhãn sản phẩm PCR trong quá trình phản ứng PCR cuối cùng sẽ dẫn đến định lượng trực tiếp. Khi các sản phẩm PCR được tích lũy, các tín hiệu huỳnh quang cũng được tích lũy và chúng sẽ được đo bằng máy thời gian thực. SYBR Green và Taqman là hai phương pháp để phát hiện hoặc theo dõi quá trình khuếch đại của PCR thời gian thực. Cả hai phương pháp đều theo dõi tiến trình của quá trình khuếch đại và báo cáo số lượng của sản phẩm theo thời gian thực.
Hình 03: PCR thời gian thực
Real-time PCR có nhiều ứng dụng như định lượng biểu hiện gen, phân tích microRNA và RNA không mã hóa, định kiểu gen SNP, phát hiện các biến thể số bản sao, phát hiện các đột biến hiếm gặp, phát hiện sinh vật biến đổi gen và phát hiện các tác nhân lây nhiễm.
Điểm giống nhau giữa xét nghiệm PCR lồng nhau thông thường và xét nghiệm PCR thời gian thực là gì?
- Xét nghiệm PCR lồng nhau và thời gian thực là những sửa đổi của xét nghiệm PCR thông thường.
- Cả ba kỹ thuật đều khuếch đại mẫu DNA.
- Sản phẩm của họ có thể được sử dụng để giải trình tự hoặc phân tích.
- Những xét nghiệm này yêu cầu mồi.
Sự khác biệt giữa các xét nghiệm PCR lồng nhau và thời gian thực thông thường là gì?
PCR thông thường là một kỹ thuật được phát triển để khuếch đại các trình tự DNA cụ thể. Trong khi đó, PCR lồng nhau là một sửa đổi của PCR thông thường bao gồm hai phản ứng khuếch đại tuần tự và PCR thời gian thực là một biến thể của PCR thông thường có khả năng định lượng sản phẩm được khuếch đại. Vì vậy, đây là điểm khác biệt chính giữa xét nghiệm PCR lồng nhau thông thường và xét nghiệm PCR thời gian thực. Không giống như PCR thông thường và thời gian thực, PCR lồng nhau sử dụng hai bộ mồi. Hơn nữa, có hai phản ứng khuếch đại liên tiếp trong PCR lồng nhau để giảm sự khuếch đại không đặc hiệu. bên cạnh đó, các xét nghiệm PCR thông thường và thời gian thực không chứa hai phản ứng khuếch đại tuần tự.
Đồ họa thông tin sau liệt kê sự khác biệt giữa xét nghiệm PCR lồng nhau thông thường và xét nghiệm PCR thời gian thực ở dạng bảng để so sánh song song.
Tóm tắt - Thử nghiệm PCR Thông thường so với lồng nhau và Thời gian thực
PCR thông thường là kỹ thuật đầu tiên được phát triển để khuếch đại các đoạn DNA cụ thể. PCR lồng nhau và PCR thời gian thực là hai biến thể của PCR thông thường. Có hai phản ứng khuếch đại tuần tự và sử dụng hai bộ mồi trong PCR lồng nhau. PCR thời gian thực được phát triển để định lượng sản phẩm PCR khuếch đại. Do đó, điều này tóm tắt sự khác biệt giữa các xét nghiệm PCR lồng nhau thông thường và xét nghiệm PCR thời gian thực.
