Sự khác biệt chính - Mồi PCR so với Mồi trình tự
Với sự phát triển gần đây trong lĩnh vực sinh học phân tử, các kỹ thuật di truyền khác nhau đã được phát triển để làm cho quá trình điều tra các con đường khác nhau của đối tượng trở nên dễ dàng và chính xác. PCR và các thủ tục giải trình tự khác là hai kỹ thuật quan trọng như vậy. Chúng sử dụng các thành phần con khác nhau. Mồi được coi là thành phần phụ chính chung cho cả kỹ thuật PCR và giải trình tự. Các đoạn mồi PCR được sử dụng để khuếch đại một trình tự DNA cụ thể trong khi các đoạn mồi giải trình tự được sử dụng trong bối cảnh giải trình tự một đoạn DNA với mục đích tiết lộ thứ tự cụ thể của trình tự nucleotide. Đây là điểm khác biệt chính giữa mồi PCR và mồi trình tự.
Sơn lót PCR là gì?
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật di truyền được sử dụng trong lĩnh vực sinh học phân tử để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA cụ thể và thu được nhiều triệu bản sao giống hệt nhau. Trong phản ứng PCR, các thành phần khác nhau được sử dụng bao gồm mồi. Mồi là những sợi DNA ngắn với chiều dài nucleotide từ 18-25 làm cho chúng tương thích với vùng bắt đầu và vùng kết thúc của đoạn DNA cần khuếch đại. Sơn lót có thể là sơn lót thuận và sơn lót ngược. Các đoạn mồi này liên kết với đoạn DNA tại các điểm cụ thể mà nó tạo ra DNA polymerase để liên kết với đoạn mồi cụ thể tại vị trí đó và bắt đầu quá trình tổng hợp sợi DNA mới.
Việc lựa chọn mồi là một khía cạnh quan trọng của quá trình PCR. Việc lựa chọn độ dài của lớp sơn lót rất quan trọng. Chiều dài lý tưởng sẽ là 18-25 nucleotide. Nếu độ dài quá ngắn hoặc quá dài, các đoạn mồi sẽ không liên kết với chuỗi DNA được khuếch đại chính xác. Các đoạn mồi có chiều dài quá ngắn dẫn đến việc ủ đoạn mồi không đặc hiệu tại các vị trí khác nhau của chuỗi DNA.
Hình 01: Sơn lót PCR
Hàm lượng Guanine và Cytosine (GC) trong một loại kem lót tốt nên nằm trong khoảng 40-60. Nhiệt độ ủ mồi và nhiệt độ nóng chảy là những yếu tố quan trọng trong quá trình PCR. Nhiệt độ nóng chảy phải được tính toán chính xác, và nhiệt độ ủ lớp sơn lót phải nhỏ hơn nhiệt độ nóng chảy 50C. Nhiệt độ nóng chảy phải là 60 ° C và 75 ° C. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp sẽ dẫn đến hoạt động của DNA polymerase kém hoạt động hơn.
Sơn lót trình tự là gì?
Các đoạn mồi trình tự được sử dụng trong bối cảnh giải trình tự một đoạn DNA với mục đích tiết lộ danh tính cụ thể của nó. Để có được kết quả giải trình tự tốt, mồi và mẫu chất lượng cao là rất quan trọng. Do đó, khi các đoạn mồi được chọn, chúng phải là duy nhất cho một vùng cụ thể mà chúng ta muốn trình tự. Nó cũng phải có định hướng chính xác nơi các trình tự thường được tạo ra từ 3 'đến 5' đầu của mồi. Trình tự phải thiếu sự tự lai không mong muốn chẳng hạn như sự hình thành các vòng kẹp tóc. Nó không được chứa các bazơ Guanin hình thành liên tiếp.
Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi phải phù hợp với các điều kiện của trình tự. Do đó, nó phải nằm giữa 52oC và 74oC. Việc chuẩn bị các oligonucleotit được sử dụng làm mồi phải được tinh chế để có được độ dài đầy đủ mong muốn của trình tự. Nếu các oligonucleotide chứa tạp chất, tín hiệu trình tự mồi sẽ được chồng lên từ các vị trí mồi khác nhau, và nó cũng sẽ làm giảm số lượng tế bào cơ sở.
Hình 02: Sơn lót trình tự
Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm) của oligonucleotide xác định mức độ mạnh mẽ của các sợi DNA bổ sung được lai với nhau. Tm có thể được coi là một phép tính nhiệt động lực học khi nó phụ thuộc vào cả trình tự DNA và một số điều kiện như nồng độ muối. Tm rất quan trọng trong quá trình PCR trong đó một biến thể được gọi là giải trình tự chu kỳ được sử dụng để tạo ra một nhóm các đoạn kết thúc bằng dideoxynucleotide. Ở đây, mồi được sắp xếp theo trình tự ban đầu sẽ được ủ xen kẽ, sau đó được kéo dài và biến tính cuối cùng để khuếch đại. Do đó, giá trị Tm phải nằm trong khoảng từ 52oC đến 74oC. Các oligonucleotide tổng hợp có thể thu được từ các phòng thí nghiệm tổng hợp DNA / RNA theo sự lựa chọn. Quy mô tổng hợp nhỏ được sử dụng để giải trình tự DNA thường là 50 nmol. Ngoài ra, điều quan trọng nhất là các chất mồi được sử dụng để giải trình tự phải được tinh chế để không có tạp chất sẽ tránh làm giảm chất lượng.
Điểm giống nhau giữa mồi PCR và mồi trình tự là gì?
- Cả Mồi PCR và Mồi Trình tự đều là những mồi được sử dụng trong quá trình khuếch đại của một trình tự DNA mục tiêu.
- Cả Mồi PCR và Mồi giải trình tự đều bao gồm các nucleotide.
- Cả PCR Primers và Sequencing Primers đều là những chất kết dính ngắn.
Sự khác biệt giữa mồi PCR và mồi trình tự là gì?
PCR Primers so với Sequencing Primers |
|
| mồi PCR là các sợi DNA ngắn với độ dài trình tự nucleotide từ 18-25 làm cho chúng tương thích với vùng bắt đầu và vùng kết thúc của các đoạn DNA cần được khuếch đại. | Các đoạn mồi trình tự là các đồng phân ngắn được sử dụng trong bối cảnh giải trình tự một đoạn DNA với mục đích tiết lộ danh tính cụ thể của nó. |
| Chức năng | |
| mồi PCR được sử dụng để khuếch đại một trình tự DNA cụ thể. | Các đoạn mồi trình tự được sử dụng trong bối cảnh giải trình tự một đoạn DNA với mục đích tiết lộ danh tính cụ thể của nó. |
| Số lượng mồi cần thiết | |
| Hai lớp sơn lót; một lớp sơn lót thuận và một lớp sơn lót ngược được sử dụng làm mồi PCR. | Chỉ cần một lớp lót làm lớp lót trình tự. |
Tóm tắt - PCR Primers vs Sequencing Primers
Các đoạn mồi trình tự được sử dụng trong bối cảnh giải trình tự một đoạn DNA với mục đích tiết lộ danh tính cụ thể của nó. Một đoạn mồi trình tự sẽ đủ để chạy quá trình. Để có được kết quả giải trình tự tốt, mồi và mẫu chất lượng cao là rất quan trọng. Do đó, khi các đoạn mồi được chọn, chúng phải là duy nhất cho một vùng cụ thể mà chúng ta muốn trình tự. PCR Mồi là những sợi DNA ngắn với chiều dài nucleotide từ 18-25 tương thích với vùng bắt đầu và vùng kết thúc của đoạn DNA cần được khuếch đại. Mồi PCR có thể là mồi thuận và mồi ngược. Hàm lượng Guanine và Cytosine (GC) trong một loại sơn lót tốt nên nằm trong khoảng 40-60. Nhiệt độ ủ mồi và nhiệt độ nóng chảy là những khía cạnh quan trọng trong quá trình PCR. Đây là sự khác biệt giữa mồi PCR và mồi trình tự.
