Sự khác biệt chính - SYBR Green vs Taqman
SYBR Green và Taqman là hai phương pháp được sử dụng để phát hiện hoặc theo dõi quá trình khuếch đại của PCR thời gian thực. SYBR Green là một phương pháp dựa trên việc xen kẽ thuốc nhuộm liên kết axit nucleic trong khi Taqman là một phương pháp dựa trên đầu dò thủy phân. Cả hai công nghệ đều được thiết kế để tạo ra huỳnh quang trong quá trình PCR, cho phép máy PCR thời gian thực theo dõi phản ứng trong “thời gian thực”. Phương pháp SYBR Green được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là SYBR xanh và phát hiện sự khuếch đại bằng cách liên kết thuốc nhuộm với DNA sợi đôi được tạo ra. Taqman được thực hiện bằng cách sử dụng các đầu dò được gắn nhãn kép và phát hiện sự khuếch đại bằng cách suy thoái đầu dò bởi Taq polymerase và giải phóng fluorophore. Đây là điểm khác biệt chính giữa SYBR Green và Taqman.
SYBR Green là gì?
SYBR Green là thuốc nhuộm huỳnh quang dùng để nhuộm axit nucleic, đặc biệt là DNA sợi kép trong Sinh học phân tử. Phương pháp SYBR Green được sử dụng để định lượng các sản phẩm PCR trong quá trình PCR thời gian thực. Khi nó liên kết với DNA, phức hợp nhuộm DNA tạo thành sẽ hấp thụ ánh sáng xanh lam và phát ra ánh sáng xanh lục cực mạnh. Nó xảy ra do sự thay đổi cấu trúc xảy ra trong phân tử thuốc nhuộm khi liên kết với DNA sợi kép. Khi PCR tạo ra ngày càng nhiều DNA, nhiều phân tử thuốc nhuộm liên kết với DNA, tạo ra nhiều huỳnh quang hơn. Do đó, sự phát huỳnh quang tăng lên khi tích lũy sản phẩm PCR. Do đó, lượng sản phẩm PCR có thể được đo định lượng bằng phát hiện huỳnh quang xanh SYBR.
Thuốc nhuộm màu xanh lá câySYBR cũng có thể được sử dụng để ghi nhãn DNA trong phép đo tế bào và kính hiển vi huỳnh quang. Ethidium bromide đã được thay thế thành công bởi SYBR Green vì Ethidium bromide là một loại thuốc nhuộm gây ung thư với các vấn đề về thải bỏ trong quá trình hình dung DNA trong điện di trên gel.
Có những ưu và nhược điểm của phương pháp SYBR xanh. Phương pháp này rất nhạy, rẻ tiền và dễ sử dụng. Tuy nhiên, do khả năng liên kết với bất kỳ DNA sợi đôi nào, liên kết không đặc hiệu có thể dẫn đến định lượng quá mức sản phẩm PCR.
Hình 01: Kỹ thuật Xanh SYBR
Taqman là gì?
Taqman là một phương pháp thay thế cho SYBR Green để theo dõi quá trình PCR thời gian thực. Phương pháp này phụ thuộc vào hoạt tính exonuclease 5’- 3’ của enzyme Taq polymerase để phân hủy các mẫu dò trong quá trình kéo dài sợi mới và giải phóng fluorophore. Các đầu dò có nhãn kép được sử dụng trong phương pháp này và nó dựa trên sự thủy phân của các đầu dò. Đầu dò là các oligonucleotide DNA được đánh dấu huỳnh quang có phân tử phóng xạ huỳnh quang (fluorophore) ở đầu 5’và phân tử dập tắt ở đầu 3’. Chúng được thiết kế để liên kết với khuôn mẫu sợi đơn ở phía đối diện của lớp sơn lót. Taq polymerase thêm nucleotide vào đoạn mồi và kéo dài sợi mới về phía các đầu dò có nhãn kép. Khi Taq polymerase gặp đầu dò, hoạt động exonuclease của Taq polymerase sẽ kích hoạt và làm suy giảm đầu dò. Khi nó hoàn thành quá trình tổng hợp sợi mới, đầu dò sẽ bị phân hủy hoàn toàn và giải phóng fluorophore. Sự giải phóng fluorophore tạo ra huỳnh quang. Phân tử Quencher huỳnh quang dập tắt ánh sáng phát ra một cách hiệu quả và tạo ra đầu ra để định lượng sản phẩm PCR. Sự giải phóng các fluorophores và số lượng của các sản phẩm PCR là tỷ lệ thuận. Do đó, việc định lượng có thể dễ dàng thực hiện bằng phương pháp Taqman.
Hình 02: Phương pháp Taqman
Phương pháp Taqman được sử dụng trong PCR thời gian thực, định lượng biểu hiện gen, phát hiện đa hình di truyền, định lượng sự mất đoạn DNA của nhiễm sắc thể, xác định vi khuẩn, xác minh phân tích microarray, định kiểu gen SNP, v.v.
Sự khác biệt giữa SYBR xanh và Taqman là gì?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green dựa trên chất nhuộm liên kết DNA. | Taqman phụ thuộc vào các đầu dò lai và hoạt tính exonuclease từ 5’đến 3’ của Taq polymerase. |
| Đầu dò được gắn nhãn huỳnh quang | |
| Không cần đầu dò được dán nhãn huỳnh quang. | Cần có các đầu dò có nhãn kép. |
| Phân tích gen đa hợp | |
| Nó không thể được sử dụng cho các mục tiêu đa gen. | Nó có thể được sử dụng cho các mục tiêu đa gen. |
| Chi phí | |
| Cái này ít tốn kém hơn. | Cái này đắt hơn. |
| Tính cụ thể | |
| Điều này ít cụ thể hơn và liên kết với bất kỳ DNA sợi đôi nào | Những điều này rất đặc biệt vì các đầu dò phát hiện các sản phẩm khuếch đại cụ thể. |
| Hiệu quả | |
| Cách này kém hiệu quả hơn. | Điều này có hiệu quả cao. |
| Đơn | |
| Điều này được sử dụng trong PCR thời gian thực, trực quan hóa gel agarose, ghi nhãn DNA, v.v. | Điều này được sử dụng trong PCR thời gian thực, định lượng biểu hiện gen, phát hiện đa hình di truyền, v.v. |
Tóm tắt - SYBR Green và Taqman
Taqman và SYBR xanh là hai phương pháp được sử dụng trong PCR thời gian thực (PCR định lượng). Cả hai phương pháp đều cho phép định lượng sản phẩm PCR một cách hiệu quả và dựa vào sự phát huỳnh quang. Phương pháp Taqman sử dụng các đầu dò được đánh dấu kép để phát hiện DNA tích lũy trong khi phương pháp SYBR Green sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang. Cả hai phương pháp này cũng có những ứng dụng khác nhau trong sinh học phân tử.
